Đề tài: Phát hiện và đếm Coliforms trong nước uống, các phương pháp hiện thời và phương pháp tiếp cận nổi bậc (2024)

• Phát hiện Coliforms trong nước uống
• Đếm Coliforms trong nước uống
• Coliforms trong nước uống
• Phương pháp phát hiện Coliforms
• Phương pháp tiếp cận Coliforms
• Tiếp cận Coliforms

1. BÔCÔNGTH ̣ ƯƠNG TRƯỜNGĐẠIHỌCCÔNGNGHIỆPTHỰCPHẨM THÀNHPHỐHỒCHÍMINH KHOACÔNGNGHỆTHỰCPHẨMMôn:PhânTíchViSinhTh ựcPh ẩmĐềTài: DetectionAndEnumerationOfColiformsInDrinking Water:CurrentMethodsAndEmergingApproaches (PhátHiệnVàĐếmColiformsTrongNướcUống:Các PhươngPhápHiệnThờiVàPhươngPhápTiếpCận NổiBậc)GVGD:PhanThịKimLiên TP.HCM,THÁNG11­2014
2. PhânTíchViSinhThựcPhẩmGVGD:PhanThịKimLiên Trang2
3. PhânTíchViSinhThựcPhẩm MỤCLỤCMỤCLỤC ......................................................................................................... 3TÓMTẮT ......................................................................................................... 4 1. Giới Thiệu.......................................................................................................................51.1. Coliforms là gì?...............................................................................................................7 2. Mục Tiêu.......................................................................................................................10 3. Phương Pháp Cổ Điển.................................................................................................103.1. Kỹ thuật lên men nhiều ống..........................................................................................103.2. Kỹ thuật màng lọc.........................................................................................................12 4. Phương Pháp Enzyme.................................................................................................154.1 Nguyên tắc chung..........................................................................................................154.2. Kỹ thuật có/ không có sự hiện diện của vi khuẩn và đếm bằng các kỹ thuật nhiều ốngsử dụng phương pháp enzyme...........................................................................................174.3. MF kỹ thuật liên hợp với phát hiện enzyme của vi khuẩn............................................204.4. Xác định trực tiếp hoạt tính của enzyme bằng fluorimetry...........................................214.5. Phát hiện vi khuẩn bằng phương pháp sử dụng enzyme đếm tế bào pha rắn...........224.6. Kết luận về phương pháp enzyme...............................................................................23 5. Phương Pháp Phân Tử ...............................................................................................245.1. Phương pháp miễn dịch ..............................................................................................245.2. Phương pháp dựa trên axit nucleic .............................................................................28 6. Kết Luận.......................................................................................................................41LỜICẢMƠN ................................................................................................ 44GVGD:PhanThịKimLiên Trang3
4. PhânTíchViSinhThựcPhẩmTÓMTẮT Nhómcoliformđượcsử dụngrộngrãinhư mộtchỉ tiêucủachấtlượng nướcvàvề phươngdiệnlịchsử đãdẫnđếnkháiniệmbảovệ sứckhỏecộng đồng.Mụcđíchcủaviệcxemxétnàylàđể kiểmtraphươngpháphiệnđangđượcsửdụnghoặccóthểđượcđềxuấtchoviệckiểmtrađịnhlượngcoliformstrongnướcuống. Trênthựctế,nhucầuvềcácthử nghiệmnhanhhơn,nhạyhơnvàcụ thểhơnlàđiềucầnthiếttrongngànhcôngnghiệpnước.Cáckỹthuậtthôngthườngvàđượcthừanhậnrộngrãi,đãđượcthảoluận,nhưlàcácphươngphápnổibậc từsựpháttriểncủacácnghiêncứugầnđây. Phươngpháptruyềnthốngđãđượcchấpnhậnđể pháthiệncoliformbaogồmkỹthuậtlênmennhiềuống(MTF)vàkỹthuậtmànglọc(MF)sửdụngmôitrườngnuôicấycụthểvàđiềukiệnủ khácnhau.Nhữngphươngphápnàyvẫn cònnhữnghạnchế,chẳnghạnnhưthờigian ủbệnh,sựcanthiệpsinhvậtđốikháng,thiếutínhcụthểvàviệcpháthiệnkémđốivớicácvisinhvậtpháttriểnchậmhoặccóthể pháttriểnvàtồntạimàkhôngnuôicấy.Ngàynay,kỹ thuật mànglọcđơngiảnvàkhôngtốnkémlàphươngphápđượcsửdụngrộngrãinhất choviệcđịnhlượngthôngthườngcoliformstrongnướcuống. Việcpháthiệncoliformsdựatrênhoạttínhenzymeđặctrưngđãcảithiện đượcđộ nhạycủacácphươngphápnày.Cácenzyme β­Dgalactosidasevà β­D glucuronidaseđượcsử dụngrộngrãiđể pháthiệnvàđịnhlượngcoliformstổng và Escherichia coli, tương ứng. Nhiều chất chromogenic và fluorogenic đượcdùngđểpháthiệncụthểhoạttínhcủacácenzymenàyvàcácthử nghiệmmang tínhthươngmạikhácnhauđượcdựatrêncácchấtcósẵnnày.Nhiềusựsosánh đãchothấynhữngthử nghiệmnàycóthể làmộtthaythế thíchhợpchocáckỹthuậtcổ điển.Tuynhiên,phươngphápnàythìđắthơn,vàthờigian ủ,mặcdù giảm,nhưngvẫncònquádàiđểchokếtquảcùngngày.GVGD:PhanThịKimLiên Trang4
5. PhânTíchViSinhThựcPhẩm Cáccôngcụphântíchtinhvihơnnhưkỹthuậtđếmtếbàopharắncóthểđượctậndụngđểlàmgiảmthờigiancầnthiếtđể pháthiệncáchoạtđộngcủaenzyme ở vikhuẩn,vớimộtngưỡngpháthiệnthấp.Pháthiệncoliformsbằngphươngphápphântửnàycũngđượcđềcập,vìcácphươngphápnàychonhững pháthiệnrấtcụthểvànhanhchóngmàkhôngcầnnuôicấy. Baphươngphápphântử đượcđánhgiá ở đây:cáckỹ thuậtmiễndịch,phảnứngchuỗipolymerase(PCR)vàlaitạichỗ(ISH).Trongcáchphươngphápmiễndịch,cáckhángthể khácnhauchốnglạivikhuẩncoliformđượctạora, nhưngviệcápdụngkỹthuậtnàythườngchothấykhángthểmangtínhđặchiệuthấp.PCRcóthể đượcsử dụngđể pháthiệnvikhuẩncoliformbằngphương pháp khuếch đại tín hiệu: trình tự DNA mã hóa cho các gen lacZ (gen b­galactosidase)và genuidA (b–Dgenglucuronidase)đãđượcsử dụngđể pháthiệntổngcoliformsvàE.coli,tương ứng.Tuynhiên,việcđịnhlượngvớiPCR vẫnthiếuchínhxácvàđòihỏiphảilàmviệctrongphòngthínghiệmchuyêndụng.KỹthuậtFISHliênquanđếnviệcsử dụngcácđầudòoligonucleotideđểpháthiệncáctrìnhtự bổ sungbêntrongtế bàocụ thể.Đầudòoligonucleotideđược thiết kế đặc biệt cho phạm vi của các phân tử RNA 16S củaEnterobacteriaceaecóthểđượcsửdụngđểkiểmsoátchấtlượngvisinhcủacácmẫunướcuống.FISHnênlàmộtkỹthuậtcầnquantâmcóthểthaythếchocácphươngphápnuôicấythôngthườngđểxácđịnhnhómcoliformtrongnướcuống,vìnócungcấpcácdữliệuđịnhlượngtrongmộtkhoảngthờigiankhángắn(6–8tiếng),nhưngvẫnđòihỏinỗlựcnghiêncứu.1.GiớiThiệu Việcbảovệsứckhỏecôngđồngvàmôitrườngđòihỏinướcuốngphải antoàn,điềuđócónghĩalàkhôngchứaVSVgâybệnh.GiữacácVSVphântántrongcácnguồnnước,VSVgâybệnhởruộtlànhữngloạidễbắtgặpnhất.Nhưmộthệquả,cácnguồnônhiễmphântrongnướcdànhchohoạtđộngconngười phảiđượckiểmsoátchặtchẽ.Tácnhângâybệnhđườngruột,nhưEscherischia GVGD:PhanThịKimLiên Trang5
6. PhânTíchViSinhThựcPhẩmcoliO157:H7,thườnghiệndiệntạinồngđộ rấtthấptrongmôitrườngnướctrongmộthệ vithựcvậtđadạng.Cácphươngphápphứctạpđượcđòihỏiđểpháthiệnrachúng,vànhữngphươngphápnàythìvôcùngtốnthờigian.Hầuhết coliformhiệndiệnvớisốlượnglớntronghệthựcvậtđườngruộtcủangườivàđộngvậtmáunóngkhác,vàvìthếnênchúngđượctìmthấytrongphânthải.Nhưmộthệ quả,coliforms,đượcpháthiện ở nồngđộ caohơnvikhuẩngâybệnh, đượcsử dụngnhư mộtchỉ số thểhiệnsựhiệndiệntiềm ẩncủatácnhângâybệnhđườngruộttrongmôitrườngnước.Việcsửdụngcácnhómcoliform,vàcụthểhơnlàE.coli,nhưmộtchỉsốvisinhcủachấtlượngnướccótừsựphânlậpđầutiêncủacácvisinhvậtnàytừphânvàocuốithế kỷthứ19.Coliformscũng thườngđượctìmthấytrongmôitrườngtựnhiênđadạng,nhưmộtvàiloàitrong sốđócónguồngốctừ đất,nhưngnướcuốngkhôngphảilàmộtmôitrườngtựnhiêncủachúng.Sựhiệndiệncủachúngtrongnướcuốngítnhấtphảiđượccoi làmộtmốiđedọahoặcdấuhiệucủavisinhvậtvềsựsuythoáicủachấtlượng nước.Sốmẫucoliformtổngdươngtínhtrongmộtnguồnnướcđãđượcxửlýmàthườngkhôngcócoliformthìcóthểlàchỉraviệcxửlýkhôngcóhiệuquả,mất mátcủachấtkhử trùng,bị chọcthủng(McFetersvàcáccộngsự,1986),sựxâm nhậpcủanướcônhiễmvàocácnguồncungcấpnướcsinhhoạt(Geldreichvà cáccộngsự,1992;Clarkvàcáccộngsự,1996)hoặccácvấnđề táisử dụng(LeChevallier,1990)tronghệthốngphânphối,và,nhưmộthệquả,khôngđượcchophép. Việcsửdụngcácnhómcoliformnhưmộtchỉsốvềviệccóthểhiệndiệncáctácnhângâybệnhđườngruộttrongcáchệ thốngthủysinhlàmộtđề tàitranhluậntrongnhiềunăm.Nhiềutácgiảđãbáocáodịchbệnhquađườngnướctrongcuộchọpquyđịnhcoliformtrongnước(Paymentvàcáccộngsự,năm1991;Moorevàcáccộngsự,1994;MacKenzievàcáccộngsự,1994;Goftivàcáccộng sự,1999).Tuynhiên,mụcđíchcủabàiviếtnàykhôngphảilàđể thảoluậnvềcáckháiniệmchỉ số,màlàđể xácđịnhphươngpháphiệnđangđượcsử dụngGVGD:PhanThịKimLiên Trang6
7. PhânTíchViSinhThựcPhẩmhoặccóthể đượcđề nghị choviệctheodõicoliformstrongnướcuống.Sự cầnthiếtcủacáckiểmnghiệmnhanhvànhạyhơnlàkhôngthayđổitrongngành côngnghiệpnước,vớimụcđíchlàtheodõitrựctuyếnliêntụccủacácnhàmáy xửlýnướcthải.1.1.Coliformslàgì? Cácnhómcoliformbaogồmmộtsựđadạngphongphúvề thuậtngữ chivàloài,dùcóhoặckhôngthuộchọ Enterobacteriaceae.Hầuhếtcácđịnhnghĩa coliformslàchủ yếudựatrêncácđặctínhsinhhóathôngthường.Trongcácphươngpháptiêuchuẩnchoviệckiểmtranướcvànướcthải(Part9221và9222;APHAvàcáccộngsự,1998),cácthànhviênnhómcoliformđượcmôtảnhưsau: 1.Tấtcả đềukỵ khívàhiếukhítuỳ ý,gram­,khôngbàotử,vikhuẩnhìnhquevàlênmenlactosesinhkhívàtạoaxittrongvòng48hở35 oC(Kỹthuậtlênmennhiềuống;Phần3.1)hoặc 2.Tấtcảhiếukhívàkỵkhínhiềutuỳý,gramâm,khôngbàotử,vikhuẩn hìnhquepháttriểnthànhmộtkhuẩnlạcmàuđỏ ánhkimtrongvòng24h ở35oCtrênmộtmôitrườngloạiEndocóchứalactose(mànglọckỹthuật;Phần3.2). Địnhnghĩacácthànhviêncủanhómcoliformgầnđâyđãđượcmở rộngbaogồmcácđặcđiểmkhác,chẳnghạnnhưphản ứng β­D­galactosidasedương tính(Part9223;.APHAetal,1998)(kiểmtraenzymenền,phần4.2).Vi ệctìm kiếmcácvisinhvậtβ­galactosidasedươngtínhvàđệmβ­galactoside­dươngtínhcũngchophépmộtbướcxácnhậnlênmenlactose,khiđókỹthuậtlênmennhiềuốngđượcsửdụng.Cácthử nghiệmcytochromeoxidasecũngđượcsửdụngnhưlàmộtthử nghiệmkhẳngđịnhđể loạibỏ mộtsố vikhuẩncủachiAeromonas hoặcPseudomonasmàcóthểlênmenlactose. Địnhnghĩacủavikhuẩncoliformhơikháctùythuộcvàoquốcgiahoặc cáctổ chứcchịutráchnhiệmvềcácquyđịnhgiámsátvisinh.TạiCanada,định nghĩagiốngnhưởMỹ,vàkhácvớimộtsốnướcchâuÂu.Vídụ,HiệphộiTiêuGVGD:PhanThịKimLiên Trang7
8. PhânTíchViSinhThựcPhẩmchuẩnPháp(NFT90­413vàNFT90­414;AFNOR,1990),nócóthể đượcxemlà mộtmôhìnhđạidiệncholuậtphápchâuÂu,xácđịnhcoliformstổng(TC)như: Hìnhque,khôngbàotử,gramâm,oxidaseâmtính,hiếukhíhoặckỵ khítuỳ ý.Vikhuẩncóthể pháttriểntrongsự hiệndiệncủamuốimật hoặcchấtcóhoạttínhbề mặtthaythế kháccótácdụng ứcchế sự tăng trưởngtươngtự vàlênmenlactosesinhkhívàsinhacid(hoặcaldehyde) trongvòng48giờở37±1oC. AFNOR(1990)đixahơnbằngcáchđịnhnghĩanhómcoliformkhác,baogồmcảcáccoliformchịunhiệt(còngọilàcoliformsphân,FC),vàcụthểhơn,E.colilà: Coliformschịunhiệtcócùngđặctínhlênmennhư coliforms(TC), nhưngnhiệtđộ44±0,5oC. E.colilàmộtcoliformchịunhiệt,chỉkhácmộtvàiđiều,tạoindole từtryptophanetạinhiệtđộ44±0.5oC,chokếtquảthửnghiệmmethylđỏ dương tính, không thể tạo ra acetyl­methyl carbinol và không sử dụng citratelàmnguồncarbonduynhấtcủanó. Việcsử dụngcácnhómcoliformnhư mộtchỉ sốônhiễmphânphảiphụthuộcvàocácquyđịnhnghiêmngặtcủachínhphủ (Bảng1).E.colilàcoliforms phổbiếnnhấttronghệthựcvậtđườngruộtcủađộngvậtmáunóngđộngvậtvàsự hiệndiệncủanócóthể liênquanchủ yếuđếnônhiễmphân.Dođókhông đượcphépcóE.colitrongnướcuống. CơquanBảovệMôitrườngHoaKỳ(EPA)đãphêduyệtmộtsốphươngphápđể pháthiệncoliform:cáckỹ thuậtlênmennhiều ống,kỹthuậtmànglọcvàcácthử nghiệmcómặt/khôngcómặt(baogồmcácthử nghiệmONPG–MUG).AFNOR(1990)đãphêduyệtkỹ thuậtlênmennhiều ốngvàkỹ thuật mànglọc.GVGD:PhanThịKimLiên Trang8
9. PhânTíchViSinhThựcPhẩm Cácphươngphápnàycónhữnghạnchế,chẳnghạnnhư thờigian ủ,sựcanthiệpcủasinhvậtđốikháng,thiếutínhcụ thể ở cácnhómcoliformvàđộpháthiệnkémcủađốivớicoliformspháttriểnchậmhoặcbịtổnthương.Vìthế,tùythuộcvàohệ thốngmôitrường,chỉ mộtphầnnhỏ (0,1­15%)trongtổngsốquầnthể vikhuẩncóthể đượcđếmbởiphươngphápnuôicấy(Amannvàcác cộngsự,1990).Tỷ lệ vikhuẩnkhôngnuôicấycóthể bị ảnhhưởngbởiđiềukiệnkhôngthuậnlợichovikhuẩnpháttriểntrongsuốtquátrìnhnuôicấyhoặc bởikhả năngsốngsóthoặchoạtđộngcủachúng ở trạngtháikhôngnuôicấy(VBNChoặcABNC)(RoszakvàColwell,1987;JouxvàLebaron,2000;Colwell vàGrimes,2000). Bảng1.Mộtsốquyđịnhchốngnhiễmkhuẩnhiệnvàhướngdẫnchonướcuống Yêucầugiámsát Coliformtổng E.coli Mậtđộ Mẫu/tháng 0/100ml(95%)United một mẫu liên tiếp từ 0/100 ml ≈ 1/1000 sinhStatesa cùngvịtríkhôngđược (100%) vật cócoliform 0/100ml(90%) khôngnênchứanhiều hơn10CFU/100ml 0/100 ml 9000thếgiớic (100%) sinhvật)GVGD:PhanThịKimLiên Trang9
10. PhânTíchViSinhThựcPhẩm a.CơquanBảovệMôitrườngHoaKỳnăm1990. bBộytếCanada,1996. cTổchứcYtếThếgiới,1994.2.MụcTiêu Vìnướcuốnglàchếđộnghèodinhdưỡng,cácphươngphápnuôicấykém nhạytrongviệcpháthiệncáctế bàovikhuẩnbị tổnthươngvàsắpchếtcóthểtạoranhữnghạnchếnghiêmtrọngdoviệcđánhgiáquáthấpmứcđộ ônhiễm.Cótồntạicácphươngphápkhácmàcóthểđượcsửdụngđểpháthiệncoliform, vàlànhữngtrạngtháikhácnhaucủasựpháttriểnvàứngdụng.Đánhgiánàymô tảcácnguyêntắcvàcáccáchthứcthôngthườngcủaphươngphápcổđiển,cũngnhư mộtsố cácphươngphápđổimớivàphươngpháptiếpcậnmớinổi.Việc ứngdụngcácphươngphápkhácnhau để pháthiệncoliforms trongmộtmôitrườngnghèochấtdinhdưỡngnhư nướcuốngcũngđược đánhgiá dựatrênnhữngưuđiểmvànhượcđiểmcủachúng.Cáctiêuchínhưgiớihạnpháthiệnvàđộ nhạycủacácphươngpháp,thờigiancầnthiếtđể cóđượckếtquả vàcáckinhphícủaphòngthínghiệm(baogồmcả kỹnăng,laođộngvàchiphí)cũngđượcthảoluận.3.PhươngPhápCổĐiển 3.1.Kỹthuậtlênmennhiềuống Kỹthuậtđểđếmcoliformsbằngphươngpháplênmennhiều ống(MTF) đãđượcsử dụnghơn80nămnhư làmộtphươngphápkiểmtrachấtlượng nước. Phươngphápnàybaogồmviệccấymộtloạtcác ốngvớidungdịchpha loãngthậpphânthíchhợpcủacácmẫunước.Tạobọtkhí,hìnhthànhaxithoặctăngtrưởngnhiềutrong ốngnghiệmsau48giờ ủ ở35 oCthìcóthểlàphảnứngGVGD:PhanThịKimLiên Trang10
11. PhânTíchViSinhThựcPhẩmdươngtính.Cảmôitrườngdịchthểlactosevàlauryltryptoseđềucóthểđượcsửdụng như một môi trường nuôi cấy giả định, nhưng Seidler và các cộng sự(1981)vàEvansvàcáccộngsự (1981)đãcanthiệp,vớisốlượnglớnvikhuẩn khôngphảilàcoliform,thìsửdụngmôitrườngdichlỏnglactose.Tấtcả ốngcó phảnứngdươngtínhgiảđịnhtiếpsauđóphảithựchiệnmộtthửnghiệmkhẳng định.Sự hìnhthànhkhítrongcác ốnglênmenchứamôitrườngbrilliantgreen lactosebiletạibấtkỳthờiđiểmnàotrongvòng48giờở35 oCtạothànhmộtthửnghiệmkhẳngđịnhdươngtính.Cácthửnghiệmcoliformphân(sửdụngmộtmôi trườngcanhEC)cóthểđượcápdụngchoxácđịnhcolifomtổng(TC)màcụthểlàFC(APHAvàcáccộngsự,1998):việctạokhísau24giờ ủ ở 44,5oCtrongcanhECđượccoilàmộtkếtquảdươngtính. CáckếtquảcủakỹthuậtMTFđượcthểhiệntrongđiềukhoảnsốlượng cóthể xảyranhất(MPN)về sự hiệndiệncủavisinhvật.Cons ốnàylàmộtướclượngthốngkêcủatrungbìnhsố coliformtrongmẫu.Hệ quả là,kỹ thuậtnàyđượcđưarađểđịnhlượngsơbộcoliforms.Tuynhiên,độchínhxáccủaviệc ướclượngthìthấpvàphụ thuộcvàosốốngdùngđể phântích:vídụ,nếuchỉ1mlđượcxemxéttrongmộtmẫuchứa1coliform/ml,khoảng37%trongcácống1mlcóthểmongđợidựkiếnsẽmanglạikếtquảâmtínhvìcácphânphốingẫunhiêncủacácvikhuẩntrongmẫu.Nhưng,nếunămống,mỗi1mlmẫu,đượcsửdụng,mộtkếtquả âmtínhcóthể đượcdự kiếnsẽ íthơn1%củathờigian (APHAvàcáccộngsự,1998). Nhiềuyếutốcóthểảnhhưởngđángkểcoliformđếnpháthiệnvikhuẩn bằngMTF,đặcbiệtlàtrongsuốtgiaiđoạngiảđịnh.Sựcanthiệpcủamộtlượng lớnvikhuẩnkhôngphảilàcoliform(Seidleretal,1981;Evansvàcáccộngsự,1981; Means và Olson, 1981), cũng như bản chất ức chế của môi trường (McFetersvàcáccộngsự,1982),đãđượcxácđịnhlàyếutố gópphầnđánhgiáthấpcáccoliformđadạng.Kỹ thuậtMTFthiếuchínhxácvề địnhtínhvàđịnhlượng.Thờigiancầnthiếtđểcóđượckếtquảcaohơnsovớicáckỹthuậtkhác.GVGD:PhanThịKimLiên Trang11
12. PhânTíchViSinhThựcPhẩm KỹthuậtmànglọcđãthaythếkỹthuậtMTFtrongnhiềutrườnghợpchoviệckiểmtrahệthốngnướcuống.Tuynhiên,kỹthuậtnàyvẫncònhữuích,đặc biệtlàkhiđiềukiệnkhôngchophépsửdụngcáckỹthuậtlọcmàng,chẳnghạn nhưcácloạinướcđụchoặccómàu. MTFlàdễ thựchiệnvàcóthể đượcthựchiệnbởimộtkỹ thuậtviênđượcđàotạocơ bảnvề visinh,nhưngphươngphápnàycóthể trở nênrấtdàidòngvàcầnnhiềunhâncôngvìnhiềudungdịchphaloãngđãđượcxửlýchomỗi mẫunước.Tuynhiên,nótươngđốilàkhôngtốnkém,vìnókhôngđòihỏithiếtbị phòngthínghiệmphứctạp.Tuynhiên,phươngphápnàylàcựckỳ tốnthời gian,đòihỏi48hchokếtquảgiảđịnh,vàbuộcphảicómộtgiaiđoạnnuôicấy lạiđểkhẳngđịnhmàcóthểmấtlêntớihơn48h. 3.2.Kỹthuậtmànglọc Cácmànglọckỹthuật(MF)đãhoàntoànđượcchấpnhậnvàđãđượcphêduyệtnhư mộtthủ tụcđể theodõichấtlượngvisinhvậttrongnướcuống ởnhiềuquốcgia.Phươngphápnàybaogồmlọcmộtmẫunướctrênmộtmànglọcvôtrùngvớikíchthướclỗ0,45mmmàvẫngiữlạivikhuẩn,ủmànglọcnàytrên môitrườngchọnlọcvàđếmcáckhuẩnlạcđiểnhìnhtrêncácmànglọc. NhiềumôitrườngvàđiềukiệnủchophươngphápMFđượcthửnghiệm choviệcphụchồitối ưucủacoliformstừmẫunước(GrabowvàduPreez,1979;Ricevàcáccộngsự,1987).Trongđó,đượcsửdụngphổbiếnchophântíchnước uốnglàloạimôitrườngm­EndoởBắcMỹ(APHAvàcáccộngsự,1998)vàmôi trườngTergitol­TTCởchâuÂu(AFNOR,1990).Vikhuẩncoliformhìnhthànhkhuẩnlạcmàuđỏ ánhkimtrênmộtmôitrườngloạiEndo­loạimôitrườngcóchứalactose(ủtrong24giờ ở35oCđốivớiTC)hoặckhuẩnlạcmàuvàng–camtrênmôitrườngTergitol­TTC(ủtrong24và48hở37và44oCđốivớiTCvàFC,tươngứng).Môitrườngnuôicấykhác,chẳnghạnnhưthạchMacConkeyvàmôitrườngTeepol,đãđượcsửdụngởNamPhivàAnh.Tuynhiên,sosánhgiữacácGVGD:PhanThịKimLiên Trang12
13. PhânTíchViSinhThựcPhẩmmôitrườngnuôicấythìthạchm­Endomanglạigiátrị đếmđượccaohơnthạchMacConkeyhoặcthạchTeepol(GrabowvàduPreez,1979).Để đếmcácFC, APHAvàcáccộngsự(1998)chorằngmànglọcđượcủtrênmôitrườnglàmgiàu lactose(m­FC)ởnhiệtđộ44,5oCtrong24giờ.Bởivìnhiệtđộủtăngcaovàviệcbổsungthuốcthửmuốiacidrosolic,vàikhuẩnlạckhôngphảicoliformphânpháttriểntrêncácmôitrườngm­FC(APHAvàcáccộngsự,1998). ViệcđếmTCbằngcáchlọcmàngthìkhônghoàntoànthiếtthực.KhiMF được kết hợp với môi trường nuôi cấy m­Endo chứa lactose, các khuẩn lạckhôngđiểnhìnhthìcómàuđỏsẫm,nhầyhoặccónhânvàkhôngcóánhkimthỉnhthoảngcóthểxuấthiện.Khuẩnlạckhôngđiểnhìnhmàuxanh,hồng,trắnghoặc khôngmàuthiếuánhthìkhôngđượcxemtrongTCtrongkỹthuậtnày(APHAvàcáccộngsự,1998).Hơnnữa,cáckhuẩnlạcđiểnhìnhvớimộtđộóngánhđôikhiđượctạorabởivikhuẩnkhôngphảilàcoliformvàngượclại,cáckhuẩnlạckhôngđiểnhình(màuđỏ sẫmhoặckhuẩnlạccónhânmàkhôngcóánhkim)thườngkhôngphảilàcoliforms.DođóviệcxácnhậnColiformcóthểđượcchấp nhậnchocảhailoạikhuẩnlạc(APHAvàcáccộngsự,1998). VớiviệcchấpnhậnMFnhư mộtkỹ thuậtchọnlọcchoviệctheodõinướcuống(APHAvàcáccộngsự,1998;AFNOR,1990),cáccâuhỏiliênquan đếnviệcpháthiệncoliformvàtínhchínhxáccủaviệcđịnhlượngđãtănglên.Sựhiệndiệncủasốlượnglớnvikhuẩndịdưỡngnềnlàmgiảmviệchồiphụccủa coliformtrongMF(Clark,1980;Burlingamevàcáccộngsự,1984).Cáckhuẩnlạctậphợpquálớntrêncácmôitrườngm­Endođãgắnliềnvớiviệclàmgiảmcác khuẩnlạccoliformtạoraánhkim(HsuvàWilliams,1982;Burlingamevàcáccộngsự,1984). ĐiềuđángquantâmvềMFlànókhôngcókhảnăngđểphụchồicoliforms bịcăngthẳnghoặcbịtổnthương.Mộtsốyếutốhóahọcvàvậtlýliênquanđếnviệcxửlýnướcuống,baogồmviệckhửtrùng,cóthểgâyrathươngvongchovikhuẩncoliform,kếtquả làmộttế bàobị hư hỏngthìkhôngthể hìnhthànhmộtGVGD:PhanThịKimLiên Trang13
14. PhânTíchViSinhThựcPhẩmkhuẩnlạctrênmôitrườngmangtínhchọnlọc.Việcphơisángcủavikhuẩnđểtạorasảnphẩmnhư clocóthể dẫnđếntổnthươngvàtăngtínhnhạycảmvới muốimậthoặccácchấthoạtđộngbềmặtthaythế(sodiumdesoxycholatehoặc Tergitol7)chứatrongmộtsố môitrườngnuôicấychọnlọc.Mộtsố cảitiếntrongphươngphápđãtăngđộpháthiệnđốivớivikhuẩncoliformbịtổnthương,baogồmcả việcpháttriểncácmôitrườngm­T7đặcbiệtdànhchoviệcphục hồicủacoliformsbị tổnthươngtrongnướcuống(LeChevalliervàcáccộngsự, 1983).Đánhgiáthườngxuyênvềcácmẫunướcuống(LeChevalliervàcáccộng sự,1983;McFetersetal,1986)vànướcbềmặt.(McFetersvàcáccộngsự,1986;FreiervàHartman,1987)chothấysựphụchồicoliformcaohơntrênmôitrườngm­T7sovớitrênmôitrườngm­Endo.Tuynhiên,m­T7cóthể khônghiệuquảbằngm­Endokhicácbộ phậnbị tổnthươngkhácchlorinecóliênquan.Ricevàcáccộngsự(1987)đãđemlạisựkhácbiệtkhônđángkểtrongcoliformđãphục hồitrênm­T7sovớim­EndoLEStừmẫumonochloraminated,vàAdamsvàcáccộngsự (1989)thấyrằngmôitrườngm­T7khôngtốtbằngmôitrườngm­EndotrongviệcđiềutracáctếbàoE.colivàC.freundiitiếpxúcvớiozone. Cáctácgiảkhácđãgợiýrằngviệckhửtrùngbằngcloảnhhưởngđếncácchứcnăngkhácnhauvề hoạttínhcủavikhuẩncoliform,như hoạttínhenzymcatalase(CalabresevàBissonnette,1990;Sartory,1995).Vikhuẩnhoatđộngtraođổichấttạorahydrogenperoxide(H2O2),việcnàythườngnhanhchóngbị thoáihóabởicatalase.Coliformsbịthươngvớihoạttínhcủacatalasegiảmsẽtíchlũychấtđộchydrogenperoxide,màchúngthìcựckỳnhạy.CalabresevàBissonnette (1990)báocáovềsựtănglêntrongviệcphụchồicoliformtrênmôitrườngnuôicấym­Endovàm­T7,cũngnhưsựgiatăngtrongviệcphụchồiE.colitrênm­FCkhicácmôitrườngnuôicấyđượcbổsungcatalase,sodiumpyruvatehoặccảhai. Sartory(1995)chorằngsodiumpyruvatenênđượcthêmvàoởnồngđộ0,01­0,1% chobấtkỳ môitrườngpháthiệncoliformchuẩnnàovìsảnphẩmnàychophép cảithiệnviệcphụchồicủacáccoliformchịuáplựcchlorine.GVGD:PhanThịKimLiên Trang14
15. PhânTíchViSinhThựcPhẩm Sốlượnglớnmôitrườngnuôicấythayđổitrongsửdụnglàmộtphảnánhthựctếrằngkhôngcómôitrườngthôngdụngnàohiệnnaytồntạichophéptốiưuviệcđếmcácloàicoliformkhácnhaucónguồngốctừ cácmôitrườngkhácnhauvàhiệndiệnởnhiềutrạngtháisinhlý.Nhữnglợiíchđángkểcủakỹthuật MFnhiềuhơnlàphươngphápMTF,việckiểmtracácthề tíchlớncủanướclà khả thi,nhạyhơnvàđộ tincậycaohơn.MFcũnglàmộtđiềutrađịnhlượng mangtínhtươngđốivớiviệcđịnhlượngsơbộcácthôngtinđượcghinhậnbởi phươngphápMTF.MFlàmộtkỹthuậthữuíchchođasốcácphòngthínghiệm vềchấtlượngnướcvìnólàmộtphươngpháptươngđốiđơngiảnđể sử dụng. Nhiềumẫucóthể đượcxử lýtrongmộtngàyvớicácthiếtbị phòngthínghiệm bị hạnchế bằngmộtkỹ thuậtvớicáckỹ năngvisinhcơ bản.Tuynhiên,vì phươngphápnàythìchưađủ thiếtthực,mộtgiaiđoạnkhẳngđịnhlàcầnthiết,mànócóthể mấthơn24hsaugiaiđoạn ủ đầutiêntrênmôitrườngchọnlọc. Đây là lý do tại sao việc cải tiến phương pháp MF dựa trên các thuộc tính enzymecủacoliformsđãđượcđềxuất(xemmục4.3).4.PhươngPhápEnzyme 4.1Nguyêntắcchung Cácxétnghiệmsinhhóađượcsửdụngđểxácđịnhvikhuẩnvàliệtkêcác phươngphápnuôicấycổđiểnthườngđượcdựatrêncácphảnứngtraođổichất.Kếtluậnnày,chúngkhônghoàntoàncụ thể,vànhiềuxétnghiệmbổ sungnàyđôikhicầnthiếtđể cóđượcxácnhậnchínhxác.Việcsửdụngcácenzymecủavikhuẩnđểpháthiệnvikhuẩnlàmộtthaythếhấpdẫnđốivớicácphươngphápcổ điển.Phản ứngenzymecóthể lànhóm,chihoặcloàicụ thể,tùythuộcvàoenzymemụctiêu.Hơnnữa,phản ứngnhanhvànhạycảm.Như vậy,khả năngpháthiệnvàliệtkêcoliformsthôngquacáchoạtđộngenzymecụ thể đãđược điềutranhiềunămnay.GVGD:PhanThịKimLiên Trang15
16. PhânTíchViSinhThựcPhẩm β­D­glucuronidase là một enzyme xúc tác thủy phân dẫn xuất β­D­glucopyranosiduronicvàoaglyconstương ứngcủachúngvàacidD­glucuronic. MặcdùenzymevikhuẩnnàyđượcpháthiệnđầutiêntrongE.coli,độđặchiệu tươngđốicủanóđể xácđịnhcácvisinhvậtnàylàkhôngrõràngchođếnkhiKilianvàBulow(1976)khảosátcácEnterobacteriaceaevàbáocáorằnghoạt độngglucuronidasechủyếulàgiớihạnE.coli.Sựphổbiếncủaenzymenàyvà tiệníchcủanótrongviệcpháthiệnvikhuẩnE.colitrongnướcsauđóđãđượcxemxétbởiHartman(1989).Phản ứngB­D­glucuronidasedươngtínhđãđượcquansáttrong94­96%củaE.coliphânlậpđượcthử nghiệm(KilianvàBulow, 1976;FengvàHartman,1982;EdbergvàKontnick,1986;.Kasparvàcộngsự, 1987),trongkhiChangvàcộngal.(1989)tìmthấymộttỷ lệcaohơncủaB­D­glucuronidaseE.coliâmtính(thờigiantrungbìnhlà15%từvikhuẩnE.coliphân lậptừ mẫuphâncủaconngười).Ngượclại,hoạtđộngB­D­glucuronidaselàítphổbiếnhơntrongchiEnterobacteriaceaekhác,chẳnghạnnhưvikhuẩnShigella (44­58%), Salmonella (20­29%) và chủng Yersinia và Flavobacteria (Kilian vàBulow, 1976; Massanti et al ., 1981; Feng và Hartman, 1982; Frampton vàRestaino,1993).B­D­galactosidase,xúctácsựphânhủycủalactosethànhglucose vàgalactosevàđãđượcsửdụngchủyếuđểliệtkêcácnhómcoliformtronghọEnterobacteriaceae. Việc sử dụng B­D­glucuronidase và các hoạt động B­D­galactosidaseđểpháthiệnvàđếmvikhuẩnE.colivàTCtươngứng,đượcxem xétởđây. Chromogenicvàchấtfluorogenicsảnxuấtmàuvàhuỳnhquang,tương ứngkhichiatáchbởimộtenzymecụthể.Cácchấtđãđượcsửdụngđểpháthiệnsựhiệndiệnhoặccáchoạtđộngcủaenzymecụthểtrongcáchệthốngthủysản(Chrost,1991).Mộtsốtácgiảđãxemxétchấtfluorogenicvàchromogenicđược sử dụngđể chẩnđoánvikhuẩn(Bascomb,1987;Manafietal,1991.).Họlưuý rằngviệcsửdụngcácchấtđãdẫnđếncảithiệnđộchínhxácvàpháthiệnnhanh hơn.Phươngpháppháthiệnhoặcđiềutracóthể đượcthựchiệntrongmộtmôi GVGD:PhanThịKimLiên Trang16
17. PhânTíchViSinhThựcPhẩmtrườngduynhất,dođóbằngcáchthôngquasự cầnthiếtcủamộtthủ tụctốn thời gian cách ly trước khi xác định. Để phát hiện sự hiện diện của B­D­glucuronidasetrongE.coli,cácchấtnềnchromogenicsau đâyđượcsử dụng:(Brenner và cộng sự, 1993) indoxyl­B­D­Glucuronide (IBDG), cácphenolphthalein­mono­B­D­glucuronide phức tạp (Butle và SBS, 1989) và 5­bromo­4­chloro­3­indolyl­B­D­glucuronide(X­Glu)(Watkinsetal,1988).Thường xuyên nhất, các chất nền fluorogenic 4 methylumbelliferyl­B­D­glucuronide (MUGlu)đãđượcsửdụng(DahlenvàLinde,1973;FengvàHartman,1982).ChấtChromogenicnhưo­nitrophenyl­B­D­galactopyranoside(ONPG),p­nitrophenyl­B­D­galactopyranoside (PNPG), 6­bromo­2­naphtyl­B­D­galactopyranoside (burger,1967)và5­bromo­4­chloro­3­indolyl­BD­galactopyranoside(X­Gal)(Leyetal.,1993)đãđượcsử dụngđể pháthiệnsự hiệndiệncủaB­D­galactosidasesản xuấtbởicoliforms,cũngnhưchấtphátquangbềmặt4­methylumbelliferyl­B­D­galactopyranoside(MUGal). 4.2.Kỹthuậtcó/khôngcósựhiệndiệncủavikhuẩnvàđếmbằngcáckỹthuậtnhiềuốngsửdụngphươngphápenzyme Sự kếthợpcủaMUGluvàolauryltryptosebrothsử dụngnhư mộtmôitrườngnuôicấychoquátrìnhlênmennhiều ống(MTF)kỹ thuậtlầnđầutiên đượcđề xuấtđể pháthiệnnhanhchóngvàxácnhậnngaylậptứcE.colitrong thực phẩm và mẫu nước (Feng và Hartman, 1982). Sự hiện diện của methylumbelliferonedosựthủyphâncủaMUGlu(mẫudươngtính)đãđượcpháthiệnbởisự tiếpxúcvớiánhsángtiacựctímsóngdàivàtrựcquancủasự pháthuỳnhquangmàuxanh­trắng.Mộtsốtácgiảđãsửdụngspectrofluorometerhoặcmộtquangphổ (Parketal,1995.)(Standridgeetal,1992;Apteetal,1995) đểgiảmngưỡngpháthiệnhuỳnhquangvàdođólàmgiảmthờigianủbệnh. Dựavàotínhchấtenzymecủavikhuẩn,mộtphươngphápxácđịnhchấtnềnđượcpháttriểnđể khắcphụcmộtsố hạnchế củaMTFvàkỹ thuậtMF. Khônggiốngnhư cácphươngphápnày,trongđóloạibỏ sự pháttriểncủaviGVGD:PhanThịKimLiên Trang17
18. PhânTíchViSinhThựcPhẩmkhuẩnkhôngphải coliformvớihóachất ứcchế,côngnghệ bề mặtđượcxác địnhdựatrênnguyêntắcrằngchỉcócácvikhuẩnmụctiêu(TCvàE.coli)đượccungcấpvàkhôngđượccungcấpchấtnềnchocácvikhuẩnkhác.Mộtbềmặt đượcđịnhnghĩađượcsử dụngnhư mộtnguồndinhdưỡngquantrọngđốivới cácvikhuẩnmụctiêu.Trongquátrìnhsử dụngchấtnền,mộtnhiễmsắchoặc mộtfluorochromeđượcpháttriểntừ bề mặt,chothấysự hiệndiệncủacácvi sinhvậtmụctiêu. EdbergvàEdberg(1988)đềxuấtsửdụngcôngnghệbềmặtkếthợpvới chấtnềnONPGchocácenzymeb­galactosidasecómặttrongtấtcảcácvikhuẩn vàMUGluchấtnềnchoviệcpháthiệncụthểcủaE.coli.Phươngphápxácđịnhchấtnềncơbảnđãđượcthànhlậpnhư làmộtkiểmtrasự hiệndiện,sự vắng mặt.Các ống, cái mà sao khi thêm mẫu vẫn không màu.Ngoài ra, được ủ ở35oC.Bấtkỳmàuvàngtrongốngnghiệm(chỉraquátrìnhthủyphâncủaONPG) đượccoilàdươngtínhđốivớiTC.Bấtkỳốngvàngđượctiếpxúcvớiánhsáng tiacựctímbướcsóngdài,vàhuỳnhquangmàuxanh­trắngthểhiệnsựhiệndiện củavikhuẩnE.coli.Khôngcóthửnghiệmxácnhậnbổsungcầnphảiđượcthực hiện. Thínghiệmđầutiên(EdbergvàEdberg,1988)chứngminhrằngkiểmtra cácchủngmôitrườngcủaTCvàE.colichothấyđộ nhạytươngđươngvớicácphươngphápcổ điển(lênđến1CFU/100ml)vớiđặctrưngcókhả nănglớn hơn.Dữliệucũngxácnhậnkhảnăngpháthiệnvikhuẩnbịthươngvớithờigianđáp ứngtốiđa24giờ.Riceetal.(1990,1991)sử dụngnhiềuchủngtinhkhiết củavikhuẩnE.coliđể xácđịnhhiệuquả củacôngnghệ pháthiệnchấtnềnđược địnhnghĩavớiB­D­glucuronidasevà chothấykếtquả tíchcực(95,5%chủngB­D­glucuronidasedươngtínhtrong24giờ và99,5%dươngtínhsau28 giờủ).KhôngcóE.coliphânlậpdương(Riceetal.,1990). Mộtsốxétnghiệmthươngmạisauđóđượcpháttriểndựatrêncôngnghệbề mặtđượcxácđịnh:Colilert(IDEXXphòngthínghiệm,Portland,ME,Mỹ), GVGD:PhanThịKimLiên Trang18
19. PhânTíchViSinhThựcPhẩmColisure(côngtyMillipore,Bedford,MA,USA),ColiQuick(Hach,Loveland,CO,USA).Hầuhếttrongsốnàylàcósẵnchomộtphản ứngsựhiệndiện/sựvắng mặtvàđếmbằngkỹ thuậtnhiều ống.Sử dụngrộngrãinhấttrongsố đólàthửnghiệmColilert,trongđósửdụngcáckỹthuậtbềmặtđượcchỉrõtínhchấtvới ONPG và MUGlu.Rấtnhiều và rất rộng rãi so sánh giữa những thử nghiệmthươngmạivàMTFcổđiểnvàphươngpháptiếpcậnMFđãđượcthựchiệnđểliệt kê TC và E. coli trong các loại nước (Edberg và cộng sự, 1988, 1989, 1990.Clarkvàcộngsự,1991.Olsonvàcộngsự năm1991,McCartyvàcộngsự,1992;McFetersetal,1993;.Palmervàcộngsự,1993;ClarkvàElShaarawinăm1993;Colquhuonetal,1995;FrickervàFricker,1996).Kếtluậnchínhcủacácnghiêncứunàylànhữngthử nghiệmcóhiệuquả để pháthiệncácvikhuẩntừnhiềunguồnnướckhácnhau,thườnglànhạycảmnhưlàcáchtiếpcậnMTFđểpháthiệnvikhuẩnE.colivàđôikhinhạycảmhơnđể pháthiệncácTC.Gần đây,QuantiTray(QT)(IDEXX),màlàmộtphiênbảnmởrộngcủaMPNkiểmtraColilert(mộtphiênbảnMPNvớimộtsốgiớihạncácốngcũngđãđượcthương mạihóa ở giaiđoạnđầu),đượcsosánhvớicácphươngphápMF,đặcbiệtlàmẫunướcuống, bởiFrickeretal.(1997), DeRoubinetal. (1997)vàEckner (1998).Tấtcảhọđềukếtluậnkhôngcósự khácbiệtđángkể choviệcđếmE.coligiữacácphươngphápQTvàMF,trongkhikhả năngphụchồicủaTClớn hơnvớikỹthuậtQThơnsovớiphươngphápMF.McFetersetal.(1997a,b)tham khảocáctiêuchuẩnsosánhvớicácphươngphápthử nghiệmColisuređể pháthiệnvikhuẩnchịuclo:vớiColisure,thuhồiTCvàE.colibịtổnthươngbởiclo đượccảithiệnhơncácphươngpháptiêuchuẩn,kếtquảlàmộtướctínhthựctếhơnvềchỉsốvikhuẩntrongnguồncungcấpnướccôngcộng. Trongkếtluận,kiểmtradựatrêncôngnghệ bề mặtđượcxácđịnhbằngcáchsửdụngchấtchromogenicvàfluorogenicđượcápdụngchoviệcpháthiện vàđịnhlượngColiformvàE.colitrongnướcuống.Cácxétnghiệmnàydễ sửdụngvàcungcấpchomột ướctínhnhanhhơnvàthựctế hơn(đặcbiệtlàsựGVGD:PhanThịKimLiên Trang19
20. PhânTíchViSinhThựcPhẩmhiệndiệncủaClodư)cácchỉsốônhiễmvikhuẩntrongnướchơnsovớitrường hợpkhôngcósựhiệndiệncổđiểnhayMTF.Nhữngphươngphápnàycóthểtốnkémhơnsovớiphươngphápcổđiểnkhisaunàykhôngcầncácbướcxácnhận bổ sung.Khibướcxácnhậnđượcyêucầu,cácchiphíphátsinhtrongcả hai phươngpháplàtươngđương.Trongmọitrườnghợp,phươngphápenzymeđòi hỏinhânlựcíthơnvàdođóchiphícủahọvềgiátrịthươngmạithấphơn. 4.3.MFkỹthuậtliênhợpvớipháthiệnenzymecủavikhuẩn DahlenvàLinde(1973)đánhgiásự kếthợpcủaMUGluvàomôitrườngthạch để phát hiện sự hiện diện của hoạt động B­D­glucuronidase (E. coli).Brenneretal.(1993) đãpháttriểnmôitrườngthạchMI,cóchứacácMUGalfluorogenicvàIBDGchromogenic,đồngthờipháthiệnTCvàE.colitrongnước.Phươngphápnàyđãđượcchứngminhlànhạycảm,chọnlọc,cụ thể vànhanhchóng(kếtquả cósẵntrong24h)(Brennervàcộngsự,1996.).Gaudetetal. (1996)vàCiebinetal.(1995)liênquanMUGluhoặcX­Gluvớicổđiểnm­TEC vàthạchlauryltryptosevàsosánhvớicácphươngpháphiệnđạithayđổivớicácphương pháp cổ điển. Các môi trường hiện đại thay đổi môi trường thạch thườngchothấysựphụchồicaohơnhoặctươngtựnhưcủaTCvàE.coli. CácmôitrườngnuôicấythươngmạiđangcósẵnđểpháthiệncácTCvà E.coli.Chúngbaogồmcácmôitrườngnuôicấymôitrườngthạchcổđiểnđượcsử dụng cho E. coli và Coliform với các chất nền chromogenic và / hoặcfluorogenic cụ thể để phát hiện các B­D­glucuronidase và / hoặc B­D­galactosidase:thạchChromocultColiform(Merck,Darmstadt,Đức),thạchFluo­rocultE.colitrựctiếp(Merck)vàm­ColiBlue24broth(Hach)(Grant,1997). Việcsử dụngcácphươngphápđếmđĩa,baogồmcả chấtchromogenicvà/hoặcfluorogenic,chophépnhiềuhơn,nhanhchóng,dễdànghơnvàcácước tínhchínhxáchơnvề coliformvàE.colirấtnhiềutrongnướcuốnghơnsovới việcsửdụngcácphươngphápcổđiển.Chúngcóthểđượcsử dụngbởibấtkỳGVGD:PhanThịKimLiên Trang20

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

• Luận văn Tốt nghiệp: Phát triển dịch vụ logistics của Công ty Cổ phần Vinalines Logistics – Việt Nam trong điều kiện hội nhập49 p | 2774| 695
• Đề tài:" Công tác đào tạo và phát triển nguồn nhân lực tại ngân hàng TMCP Phương Đông"56 p | 470| 272
• Đề tài : Thiết kế hệ thống xử lý nước thải mì ăn liền cho nhà máy Gosaco100 p | 631| 200
• Đề tài: Thiết kế và chế tạo hệ thống băng tải phân loại và đếm sản phẩm43 p | 507| 162
• Đề tài: Thiết kế mạng doanh nghiệp26 p | 344| 101
• BÁO CÁO " ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG DỊCH VỤ NGÂN HÀNG ĐIỆN TỬ ĐỐI VỚI KHÁCH HÀNG CÁ NHÂN TẠI NGÂN HÀNG TMCP CÔNG THƯƠNG VIỆT NAM – CHI NHÁNH ĐÀ NẴNG "10 p | 287| 100
• ĐỀ TÀI " Phân tích hiệu quả hoạt động kinh doanh tại Công Ty Cổ Phần Thủy Sản Minh Hải "103 p | 110| 41
• Đề tài: Nghiên cứu phát triển du lịch sinh thái Vườn quốc gia Tràm Chim tỉnh Đồng Tháp12 p | 291| 35
• Đồ án tốt nghiệp: Thiết kế và thi công hệ thống đếm số lượng cá giống85 p | 78| 20
• Luận văn Thạc sĩ Du lịch: Nghiên cứu thị trường khách du lịch Israel và một số giải pháp thu hút khách du lịch Israel đến Việt Nam107 p | 59| 18
• Bài thuyết trinh: Xây dựng chương trình du lịch TP. HCM – Đông Nai – TP. HCM 2 ngày 1 đêm31 p | 137| 14
• Tiểu luận đề tài: Phát triển nền kinh tế thị thường định hướng xã hội chủ nghĩa16 p | 53| 14
• Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp: Tìm hiểu thực trạng và vai trò sinh kế của hoạt động dịch vụ du lịch hộ tại các xã vùng đệm vườn quốc gia Phong Nha Kẻ Bàng, tỉnh Quảng Bình82 p | 35| 12
• Báo cáo tóm tắt đề tài khoa học và công nghệ cấp ĐH: Nghiên cứu xây dựng chương trình học tập tiếng Nhật trực tuyến theo nhu cầu của người học37 p | 33| 8
• Đề tài: Dòng chảy ứng dụng các sản phẩm công nghệ mới trong thanh toán hiện đại và thực tiễn tại các tổ chức tài chính Việt Nam (part1)42 p | 46| 6
• Luận văn Thạc sĩ Khoa học lâm nghiệp: Điều tra, đánh giá hiện trạng nguồn lâm sản ngoài gỗ làm cơ sở đề xuất một số giải pháp nhằm quản lý bảo vệ rừng bền vững tại một số xã vùng đệm (Xuân Trạch và Phúc Trạch) Vườn quốc gia Phong Nha-Kẻ Bàng, tỉnh Quảng Bình60 p | 33| 5
• Luận văn Thạc sĩ Sư phạm Toán: Rèn luyện kĩ năng giải các bài toán đếm cho học sinh thông qua dạy học chủ đề tổ hợp trong trường trung học phổ thông103 p | 29| 3